Біологія
Технології

Що таке біодрук? Він схожий на звичайний друк на папері? Які чорнила він використовує та для чого?

Чим біодрук відрізняється від звичайного друку і де його використовують?

Біодрук є розширенням традиційного тривимірного друку, який використовується переважно у медичній сфері. Ці технології дуже схожі, але якщо звичний 3D-принтер створює об'єкти з пластику, металу, кераміки або навіть їстівних матеріалів на кшталт шоколаду, то біопринтер має справу із біологічною сировиною, як-от живі клітини. 

Але навіщо це? У матеріалі про лабораторне м'ясо ми згадували, як компанія Aleph Farms за допомогою 3D-біопринтингу надрукувала із клітин корів яловичий стейк. Однак м'ясо — це лише невелика частина того, що можна створювати за допомогою біодруку. Ще важливішою його роль є у галузі тканинної інженерії та регенеративної медицини. Розвиток 3D-біодруку був здебільшого мотивований обмеженою доступністю органів, необхідних для трансплантації. Створення людських тканин, шкіри, кровоносних судин та внутрішніх органів, тестування фармацевтичних препаратів, наукові дослідження — це можливі сфери використання технології біодруку, яка поки що стикається з рядом проблем. Так, надрукувати людське серце, це не теж саме, що надрукувати пластикову фігурку і навіть дещо складніше за друк будинку, але технологія з часом вдосконалюється, хоча принцип залишається майже незмінним.

Що потрібно для біодруку?

Процес починається з комп'ютерного моделювання і створення цифрової моделі майбутньої біоконструкції за системою координат. Це етап попередньої обробки, який охоплює віртуальну презентацію, за якою слідує процес біодруку. Відтак інформація з комп'ютера передається роботу, який, дотримуючись вказівок, друкує запрограмовану модель за допомогою біочорнил, у ролі яких виступають суміші з живими клітинами. Кожна тканина складається з різних типів клітин, тому у пацієнта беруть певні клітини органу чи тканини та культивують їх до тих пір, поки їх не стане достатньо для створення чорнила. В якості біопаперу використовують спеціальні біоматеріали, які імітують структуру між клітинами, тобто позаклітинний матрикс. Зазвичай обирають біорозкладні синтетичні або природні полімери, як-от гідрогелі на основі желатину, хітозану, альгінату. Ці гелі виконують різноманітні функції, основні з яких — роль тимчасових риштувань, посилення росту клітин та їх адгезія, тобто прикріплення.

Гідрогелеві риштування. EnvisionTEC / Flickr

У деяких випадках клітини самоорганізуються і без риштувань, поєднуючись один з одним подібно до того, як клітини ембріона розвиваються в утробі матері або клітини дорослої людини переміщуються заради відновлення пошкоджень. Аби стати у необхідному місці, клітини експресують сотні рецепторів і хімічних речовин, які визначають характер взаємодії із сусідніми клітинами.

То як відбувається сам процес 3D-біодруку?

Найпоширеніший метод біодруку ґрунтується на екструзії матеріалу і дуже нагадує звичайний 3D-друк. Екструзійний 3D-біопринтер — це роборука, яка рухається у трьох напрямках, і як зі шприца, видавлює гель із клітинами, пошарово створюючи тривимірну структуру. Усе відбувається при кімнатній температурі, тому клітини добре зберігаються і структура виходить однорідною.

Інший метод біодруку називається струменевим. Він має багато спільного з традиційним струменевим друком на папері. Це процес безконтактного друку, при якому краплі біочорнила наносяться на гідрогелевий субстрат або культуральну чашку під контролем комп'ютера. Імпульс тиску можна генерувати термічним або п'єзоелектричним методом. У першому випадку в результаті нагрівання до сотень градусів краплі біочорнила під тиском виштовхуються з вузького сопла на підкладку. Така технологія недорога і доволі широко використовуються. Однак краплі, отримані таким чином, змішані, невпорядковані та різного розміру, а тепловий стрес впливає на життєздатність клітин. Натомість у п'єзоелектричному механізмі краплі чорнила виштовхуються внаслідок механічної вібрації. Так краплі залишаються спрямованими, з регулярним і однаковим розміром, однак можуть пошкоджуватися клітинні мембрани.

Лазерний біодрук використовує лазери як джерело енергії для точного нанесення біоматеріалів на підкладку. Така техніка зазвичай складається з трьох частин: імпульсного лазерного джерела; стрічки з металевою плівкою, покритою рідкими біоматеріалами,; приймального субстрату. Стрічка може містити аркуш прозорого кварцового скла з дуже тонким золотим покриттям і  шар біочорнила. Коли лазер досягає золота, він нагріває його та значно розширює, виштовхуючи дуже невелику кількість біочорнила на субстрат, покритий гідрогелем, для підтримки клітинної адгезії та стійкого росту. Цей метод дуже точний і має високу роздільну здатність друку. Проте це дорого, принтери громіздкі, а процес займає багато часу.

Метод стереолітографії відрізняється від інших тим, що біочорнило вже на місці. Лазер використовується для вибіркового затвердіння невеликої кількості біочорнила, яке містить світлочутливий гідрогель. Це техніка без сопел, тому клітини залишаються непошкодженими. Крім того, загальний час друку залежить лише від товщини структури. Однак існують обмеження, серед яких: відсутність належних біосумісних і біорозкладних полімерів, шкідливий вплив залишкових токсичних реагентів фототвердіння, неможливість повністю видалити несучу конструкцію.

Отже, різні методи використовуються для різних потреб, а в деяких випадках вони поєднуються, щоб покращити ефективність біодруку. Але який би метод не використовувався, далі отриману конструкцію відправляють у біореактор, де відбувається останній етап — постобробка. Тут у спеціальних резервуарах підтримуються оптимальні умови для дозрівання матеріалу, освоєння клітинами простору гелю, який поступово розчиняється, та утворення тканини.

Після завершення всіх цих етапів надрукована структура, гіпотетично, має бути готовою для трансплантації. Проте створення складних, функціональних органів — задача не з легких, над якою працюють з появи 3D-біодруку.

Процес біодруку в чашці Петрі. Philip Ezze / Wikimedia Commons

А коли і як з'явився 3D-біодрук?

Експериментальна практика почалася з розробок Ентоні Атала (Anthony Atala) — директора Інституту регенеративної медицини Уейк Форест у Північній Кароліні. Він навчився вирощувати з власних клітин пацієнтів штучні сечові міхури, м'язи, шкіру, уретру і піхву. Першими з них почали вживляти сечові міхури. Це відбулося ще в 1999 році, а зараз вже десятки людей живуть з органами, створеними під керівництвом Атала. Але тут мова йде саме про вирощування органів, тобто дуже витончену ручну роботу, яку складно масштабувати, а не біодрук.

У 2003 році Томас Боланд (Thomas Boland) застосував звичайний струменевий 3D-принтер заради автоматизації й розширення технології. Здавалося, що вже скоро почнуть друкувати будь-які органи, але виникло ще більше перешкод. Друк такими делікатними структурами як клітини та біоматеріали стикається з великою кількістю проблем, таких як вибір чорнил, факторів росту, умов дозрівання, структурна нестабільність і виживання клітин загалом. Тож, з одного боку, біопринтер відкриває дорогу для нових розробок і дослідів, особливо після появи першого комерційного апарата Organovo, що з'явився в 2009 році, але з іншої ставить перед вченими ще більше перешкод.

Що з того часу вже навчилися друкувати?

За цей час вчені встигли в рамках досліджень надрукувати такі структури, як кістки, м'язи, кровоносні судини, хрящі, еквівалент строми рогівки та інші. Більшість зі створених структур були виконані у мініатюрному масштабі й деякі з них досліджували на тваринах.

У 2016 році було представлено інтегрований принтер тканин і органів (ITOP), який може виготовляти стабільні тканинні конструкції людського масштабу, як-от фрагмент щелепної кістки, хрящі вуха, скелетні м'язи. Розвиток спрямовується на виробництво тканин для людського застосування та створення складніших тканин і органів, але все ж готові конструкції у рамках перших досліджень перевіряли на тваринах.

Утім, декому з людей у рамках клінічних випробувань і спеціальних програм все ж пощастило пройти операції із пересадки хрящів, надрукованих на 3D-біопринтері. Зокрема, китайські дослідники у 2018 році допомогли дітям із мікротією, тобто вродженою деформацією зовнішнього вуха. Нові вуха виростили з власних клітин п'яти пацієнтів віком від 6 до 9 років. Процес включав комп'ютерну томографію здорових вух, які стали зразком для 3D-моделі надрукованих, виготовлення силіконових форм для біорозкладної основи і нанесення на неї хондроцитів — клітин хрящової тканини. Кожне вухо вирощували ще близько трьох місяців перед пересадкою. Відторгнення після операції не було, але поки за дітьми все ще ведеться нагляд. Та це експериментальна медицина, де пацієнтів обирала спеціальна комісія, і для широкого загалу подібні операції поки недоступні, хоча надрукувати хрящі найлегше.

Що ж з іншими органами? Якщо вже говорити про складні структури, як-от серце, печінка або нирки, то тут все набагато ще важче, хоча той же Ентоні Атала ще у 2011 році прямо на конференції TED продемонстрував прототип штучної нирки, надрукованої на 3D-біопринтері.

Що не так з тією надрукованою ниркою? І у чому складність друку таких органів?

Нирка, надрукована командою Атала, виглядала дуже реалістично і справила враження на глядачів. Однак структура органа була дуже далекою від справжньої нирки, яку і зараз складно відтворити. Цей орган має бути пронизаний мільйонами мікроскопічних капілярних клубочків та канальців, аби із сечею видаляти непотрібні речовини, а все корисне вертати у кров. Проте нирка, створена командою доктора Атали, лише зовні нагадувала справжню — вона мала правильну форму, однак внутрішня тканина і судинна система у неї були відсутніми. Відтворення архітектури є важливою складовою, аби досягти виконання функціоналу оригінального органу. На жаль, подібною є ситуація і з печінкою, яка містить приблизно 100 мільярдів клітин різних типів. Кровоносні судини та артерії повинні доставляти кисень і поживні речовини в органи, але досягти хорошого і правильного обростання органу кровоносними судинами поки складно. А мініверсії печінки все ж створюються, хоча й не без недоліків, у лабораторіях.

Серце вважається одним з найлегше відтворюваних серед категорії складних органів, адже це, якщо сильно спрощувати, лише помпа з трубками. Поки що найчастіше дослідники займаються створенням біодрукованих серцевих тканин, що можуть використовуватися у регенерації органу і як персоналізований макет для скринінгу ліків. Наприклад, команда дослідників із Тель-Авіву зосередилася на створенні друкованих функціональних васкуляризованих серцевих пластирів, які можна було б пересадити на дефектне серце. Цей шматочок тканини інтегрує з господарем, а біоматеріали поступово деградують, залишаючи функціональну живу ділянку, яка відновлює серце.

Але друга частина дослідження у засобах масової інформації прогриміла з гучними заголовками. Дослідники перетворили жирові клітини пацієнтів на стовбурові. Їх додавали в гель, а потім обробляли, поки ті не перетворилися на серцеві клітини. Після друку вийшло майже повноцінне серце: розміром з серце кролика, яке містить клітини, кровоносні судини, камери та інші структури, необхідні серцю для нормальної роботи. Проте автори стикнулися з проблемою отримання великої кількості клітин, необхідної для створення великого органу, а також із забезпеченням довготривалого культивування органів, важливого для їх правильного дозрівання. Крім того, друкована мережа кровоносних судин все ще була обмеженою. Метою вчених є подальше удосконалення структури органа, задля подальшої трансплантації.

Друк мінісерця командою ізраїльських дослідників. TAUVOD / YouTube

Чи зможе таке серце битися? “Працюючі” серця теж вже створювали. Група американських вчених надрукувала серцевий м'яз, досягнувши високої щільності клітин і заповнення тканинних просторів, аби клітини могли битися разом, як людське серце.

Може здаватися, що надрукувати повнорозмірний орган неможливо, але американські вчені надрукували зD-модель серця, що за розміром і формою, як людське. Біочорнило з міцного і гнучкого альгінату, який отримують з морських водоростей, вводили через голку у ванну з м'яким гідрогелем, який підтримує об'єкт під час друку і згодом розкладається. Результат викликає захоплення, але це лише каркас без клітин, виготовлений як модель для тренувань хірургів.

Усі ці технології потребують серйозного удосконалення. Тому, в першу чергу, створення цих структур відбувається для їх використання у скринінгу лікарських засобів і моделювання захворювань.

Процес і результат створення моделі серця з альгінату. Eman Mirdamadi et al. / ACS Publications, 2020

Чим такі скринінги краще? Може ці моделі органів зможуть замінити тестування препаратів на тваринах?

Великий відсоток усіх експериментальних препаратів відбраковується, тому що успішні результати, отримані в лабораторіях на культурах клітин не відтворюються на живих пацієнтах. Тому вчені спеціально створюють 3D-друковані прототипи, задля вивчення розвитку захворювань, наприклад, на моделі ракових пухлин людини. Тривимірні печатні моделі більш контрольовані і краще відтворюють поведінку у тілі пацієнта, аніж клітини вирощені у чашці Петрі.

Компанія Organovo ще у 2014 році оголосила про комерційний випуск тканин печінки людини, створених за допомогою технології зD-біодруку. Вони складаються з первинних людських гепатоцитів, зірчастих та ендотеліальних клітин, які природно знаходяться в печінці людини й успішно відтворюють основні функції печінки. Тканини залишаються функціональними та стабільними щонайменше 42 дні, що дозволяє оцінити дію ліків протягом тривалості дослідження, яка значно перевищує ту, що пропонують стандартні 2D-системи культивування клітин.

З часом біодрук дійсно може допомогти в тестуванні нових препаратів, але на жаль, не замінить тварин. Випробування ліків на мишах, кроликах та інших тваринах не завжди ефективні, через те, що конкретний препарат може мати на людей зовсім інший вплив. Окремі надруковані 3D-структури хоч і можуть бути інформативнішими за двовимірні культури клітин, але все ж не відтворюють взаємодії органів та клітин на організмовому рівні. Питання використання тварин у біомедичних дослідженнях ми детальніше розглядали у матеріалі «Про мишей і людей». Тож надрукована тканина може виявитися лише додатковим засобом тестування фармацевтичних препаратів. А ось надрукована шкіра, можливо, замінить тестування косметики на тваринах.

А для пересадки шкіру друкують?

Вважається, що шкіру надрукувати легше, аніж складні органи, і в рамках досліджень досягнуто непоганих результатів, зокрема друк шкіри з кровоносними судинами. Зазвичай друк проводиться в чашці Петрі, а потім шкірі дають час дозріти в біореакторі, після чого вона придатна до пересадки на місце рани.

Але цікавішим виявляється біодрук in situ, де біочорнила друкуються прямо в місці дефекту для відновлення або створення живих тканин прямо в операційній, де рана сканується, фіксуючи її точний розмір і глибину. Чорнило для цього складається з дермальних фібробластів і клітин епідермальних кератиноцитів. Принтер наносить кожен шар шкіри безпосередньо на рану, де згодом утворюються дерма та епідерміс. Загоєння ран і повна реепітелізація спостерігалися через 8 тижнів. Такі принтери проходять стадії клінічних випробувань на тваринах — від мишей до свиней — і доволі успішно.

Щось ще можна буде лікувати в операційній?

«Ремонт» зовнішніх тканин на кшталт шкіри не такий складний, як-от можливість регенерації кісткової тканини прямо в операційній, відновлюючи дефекти, отримані через травми, рак або резекцію. Але таку технологію теж розробляють.

Ще дивнішим здається біодрук всередині людини, можливість якого продемонстрували китайські вчені. Вони розробили крихітний біопринтер, який здатен друкувати нові клітини прямо у шлунку задля лікування виразки й інших пошкоджень органу. Звичайно, однією з основних складностей «шлункового принтера»  було його зменшення. Розроблений зрештою робот отримав розміри 30 на 42 міліметри. Він вводиться в орган разом із ендоскопом у згорнутому вигляді, щоб займати менше місця, а потім розкладається до 59 міліметрів перед початком друку. Желатиново-альгінатні гідрогелі з епітеліальними клітинами та клітинами гладкої мускулатури шлунка людини були використані як біочорнила для імітації структури органу. Систему протестували на біологічній моделі шлунка, а також перевірили життєздатність клітин, нанесених на пошкоджену ділянку, отримавши обнадійливі результати. In situ in vivo — саме так називається ця концепція, яка в перспективі може застосовуватися не тільки для ремонту ШКТ, а й, припустимо, статевих шляхів, але спочатку потребує значних доробок.

Коли повноцінні друковані органи стануть реальністю?

Деякі з дослідників припускають, що технологія біодруку повноцінних складних органів стане можливою через кілька десятиліть, а хрящі та шкіра будуть широко доступні вже через кілька років.

Наші органи є результатом мільйонів років еволюції, змінивши багато форм, усуваючи не вигідні й віддаючи перевагу найбільш функціональним структурам. Як наслідок, сучасні тканини та органи є складними. Тому потрібно розібратися із великою кількістю проблем, аби друкувати органи з нервами, кровоносними судинами та іншими необхідними для забезпечення їхньої функціональності елементами.

Водночас, коли технологія розвинеться до того, що можна буде друкувати повноцінні органи, виникне ряд інших питань. Наприклад, має значення, скільки ці органи можна зберігати та при яких умовах, як довго вони зможуть функціонувати і чи не потрібно їх замінювати на нові. Перш ніж вони стануть доступними для широкого розповсюдження, на них також очікує проходження тестів на безпеку та етап регулювання, і не менш важливою буде вартість біодруку. Два десятиріччя розробок у сфері біотехнологій насправді дуже малий термін: за цей час вчені подолали багато перешкод, але попереду — ще більше.